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Feb 02, 2024

Plasmodium berghei-Oozysten verfügen über Wege zur Fettsäuresynthese und zum Abfangen von Fettsäuren

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12700 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Malariaparasiten führen die Fettsäuresynthese (FAS) in ihrem Apikoplastenorganell über eine bakterielle Verbindung durch

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12700 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Malariaparasiten führen in ihrem Apikoplastenorganell die Fettsäuresynthese (FAS) über einen bakteriell verwandten (Typ II) enzymatischen Weg durch. Im Wirbeltierwirt sind exoerythrozytische Plasmodium-Stadien auf FAS angewiesen, wohingegen intraerythrozytäre Stadien darauf angewiesen sind, FA aus ihrer Umgebung abzufangen. In der Mücke exprimieren P. falciparum-Oozysten FAS-Enzyme und sind für die Sporozoitenbildung auf diese angewiesen, P. yoelii-Oozysten exprimieren jedoch keine FAS-Enzyme und sind daher nicht auf FAS-Enzyme angewiesen, um die Sporozoitenbildung zu unterstützen. In P. berghei sind FAS-Enzyme in ähnlicher Weise für die Sporogonie entbehrlich, was darauf hindeutet, dass sie dem P. yoelii-Szenario entspricht. Wir zeigen hier, dass P. berghei unerwartet während der gesamten Oozystenentwicklung FAS-Enzyme exprimiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass P. berghei FAS neben der FA-Abfangung einsetzen kann, um Sporogonie und Übertragung zu maximieren, und P. falciparum im Hinblick auf die FA-Erfassung durch die Oozyste ähnlicher ist als bisher angenommen. Die Fähigkeit von Oozysten, zwischen FAS und Aasfressern zu wechseln, könnte ein wichtiger Faktor in der nicht konkurrierenden Beziehung der Ressourcenausbeutung zwischen Plasmodium-Parasiten und ihren Mückenvektoren sein, die die Virulenz der Parasiten sowohl bei Insekten als auch bei Wirbeltieren beeinflusst.

Malaria bleibt eine lebensbedrohliche Infektionskrankheit, die durch eine Infektion mit Apicomplexan-Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht wird, wobei P. falciparum die tödlichste unter mehreren menschlichen Malariaparasitenarten ist. Klinische Symptome werden durch asexuelle Parasiten im Blutstadium (intraerythrozytär) verursacht, von denen sich ein kleiner Prozentsatz zu Vorläuferzellen im sexuellen Stadium (Gametozyten) entwickelt, die die Übertragung durch Mücken erleichtern. Die Übertragung von Malariaparasiten beginnt mit der Aufnahme männlicher und weiblicher Gametozyten mit der Blutmahlzeit durch eine weibliche Mücke. Die wichtigsten Entwicklungsschritte, die im Inneren des Insekts stattfinden, sind: (i) Gametogenese und Befruchtung im Mitteldarmlumen; (ii) Umwandlung der Zygoten in längliche bewegliche Formen, die als Ookineten bezeichnet werden; (iii) Durchqueren des Mitteldarmepithels durch die Ookineten, gefolgt von ihrer Umwandlung in junge Oozysten; (iv) Wachstum und Teilung der Oozysten, um Tausende von Sporozoiten zu erzeugen, ein Prozess, der Sporogonie genannt wird; (v) Sporozoitenaustritt aus der Oozyste und deren Besiedlung der Speicheldrüsen der Mücke. Nach einem erfolgreichen Sporozoiten-infizierten Mückenstich entwickeln sich asexuelle Parasiten im Leberstadium (exoerythrozytär), aus denen neue Infektionen im Blutstadium ausgelöst werden, um den Plasmodium-Lebenszyklus abzuschließen.

Fettsäuren (FA) sind essentielle Zellbestandteile, die für die Biosynthese von Zellmembranen und Signalmolekülen erforderlich sind. Malariaparasiten erwerben FA sowohl durch De-novo-Synthese als auch durch Abfangen/Aufnahme aus ihrer Umgebung. Die Synthese kurz- bis mittelkettiger Fettsäuren (FAS) wird im Apikoplastenorganell, einem Relikt-Chloroplasten, durchgeführt, und eine zusätzliche FA-Verlängerung (FAE) zur Erzeugung langkettiger FA wird in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums (ER) unter Verwendung von zwei durchgeführt parallele und funktionell verwandte enzymatische Wege (Abb. 1)1. Im Mittelpunkt von FAS steht ein vierstufiger enzymatischer Zyklus, der Folgendes umfasst: (i) Kondensation von Acyl-Acyl-Trägerprotein (Acyl-ACP) mit Acetoacetyl-ACP, katalysiert durch Acyl-ACP-Elongase (FabB/F, PBANKA_0823800); (ii) Reduktion von Ketoacyl-ACP, katalysiert durch Ketoacyl-ACP-Reduktase (FabG, PBANKA_0823800); (iii) Dehydratisierung von Hydroxyacyl-ACP, katalysiert durch Hydroxyacyl-ACP-Dehydratase (FabZ, PBANKA_1338200); (iv) Reduktion von Enoyl-ACP, katalysiert durch Enoyl-ACP-Reduktase (FabI, PBANKA_1229800) (Abb. 1). FAE nutzt einen ähnlichen enzymatischen Weg, der von einer anderen Gruppe von Proteinen geleitet wird, und verwendet Coenzym A (CoA) anstelle von ACP als Acylträger (Abb. 1).

Enzymatische Wege, die an der Fettsäuresynthese (FAS) und -verlängerung (FAE) in Plasmodium beteiligt sind. An der Katalyse beteiligte Enzyme sind in roter Schrift dargestellt. FabB/F, Acyl-ACP-Elongase; FabG, Ketoacyl-ACP-Reduktase; FabZ, Hydroxyacyl-ACP-Dehydratase; FabI, Enoyl-ACP-Reduktase; ELO-A/B/C, Acyl-CoA-Elongase A/B/C; KCR, Ketoacyl-CoA-Reduktase; DEH, Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase; ECR, Enoyl-CoA-Reduktase.

Für Malariaparasiten ist die Membransynthese besonders wichtig für die Vermehrungsphasen des Lebenszyklus, dh während der Schizogonie beim Wirbeltierwirt und während der Sporogonie beim Mückenüberträger. Intraerythrozytäre Stadien von Plasmodium exprimieren keine FAS-Enzyme2,3 und das Ausschalten von FAS-Enzym-kodierenden Genen zeigt, dass sie für die Parasitenentwicklung im Blutstadium redundant sind2,3,4. Daher sind Blutstadien für ihre Entwicklung auf die Aufnahme von FA aus ihrer Umgebung angewiesen. Im krassen Gegensatz dazu exprimieren präerythrozytäre Parasitenstadien FAS-Enzyme, und ihre Erschöpfung führt zu einem Entwicklungsstopp, was zeigt, dass die Leberstadien für ihre Entwicklung auf FAS angewiesen sind1,2,3,4. Die Situation bei der Mücke ist komplexer und Studien haben Unterschiede zwischen Parasitenarten, insbesondere während der Sporogonie in der Oozyste, ergeben. Im menschlichen Malariaparasiten P. falciparum wird FabI in Oozysten exprimiert, und die genetische Verarmung von FabI oder FabB/F beeinträchtigte die Entwicklung reifer Oozysten und verhinderte die Bildung von Sporozoiten4. Diese Beobachtungen zeigen, dass P. falciparum-Oozysten für eine normale Differenzierung auf FAS angewiesen sind. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des FAS-Enzyms in Oozysten der Nagetier-Malariaparasitenart P. yoelii nicht nachgewiesen, und im Einklang mit diesem Expressionsmuster hatte die Erschöpfung von FabB/F oder FabZ keinen Einfluss auf die Entwicklung von Oozysten oder Sporozoiten3. Dementsprechend scheinen P. yoelii-Oozysten auf die FA-Abfangung angewiesen zu sein, um die normale Oozystenentwicklung und Sporogonie zu unterstützen.

Während P. yoelii- und P. falciparum-Oozysten eindeutig unterschiedliche Strategien für die FA-Erfassung verwenden, die hauptsächlich auf dem Abfangen bzw. der Synthese basieren, gibt es Indizien dafür, dass P. falciparum-Oozysten neben FAS auch FA-Abfangen nutzen können: P. falciparum-Oozystenwachstum und Sporozoiten Die Bildung reagiert empfindlich auf künstlich gesenkte Lipidspiegel im Insekt, die durch RNAi-Knockdown des wichtigsten Mückenlipidtransporters Lipophorin erreicht werden5,6,7. Darüber hinaus fördert die Erhöhung des Lipidspiegels der Mückenhämolymphe durch zusätzliche Blutfütterung nach der ersten infizierten Blutmahlzeit das Wachstum und die Reifung der Oozysten von P. falciparum erheblich6,8,9. Bei einem anderen Nagetier-Malariaparasiten, P. berghei, wurde gezeigt, dass FabG-Nullmutantenparasiten eine normale Anzahl von Oozysten bilden und Sporozoiten produzieren1, was auf eine redundante Funktion von FabG – und damit von FAS – im Oozystenstadium und damit auf einen FA-Erwerb hinweist Szenario ähnlich wie bei der eng verwandten Art P. yoelii. In dieser Arbeit zeigen wir jedoch, dass Oozysten von P. berghei, wie die von P. falciparum, Apikoplasten-residente Proteine ​​der FAS-Maschinerie exprimieren. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass die FA-Erfassung durch Oozysten, zumindest bei einigen Plasmodium-Arten, einschließlich P. falciparum, ein subtiles Zusammenspiel zwischen Synthese und Abfangen beinhaltet, um die Sporogonie und Übertragung zu maximieren.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die kristalloide Organelle von P. berghei, die ausschließlich im Ookineten- und jungen Oozystenstadium vorkommt, das NADPH-erzeugende Enzym NAD(P)-Transhydrogenase (NTH) beherbergt, das auch im stromabwärts gelegenen Sporozoiten-Apicoplasten vorhanden ist10. Da das FAS-Enzym FabG NADPH-abhängig ist (Abb. 1), haben wir untersucht, ob es wie NTH auch in Kristalloiden vorkommt. Zu diesem Zweck wurde eine transgene Parasitenlinie erzeugt, die FabG exprimiert, das an seinem Carboxyterminus mit GFP fusioniert ist. Die diagnostische PCR über die 5′-Integrationsstelle amplifizierte ein etwa 2,4 kb großes Fragment der erwarteten Größe (Abb. 2) und bestätigte die Integration des modifizierten fabg::gfp-Allels in den Zielort der resultierenden FabG/GFP-Parasitenlinie. Darüber hinaus wurde das Fehlen des parentalen Fabg-Allels in klonalen FabG/GFP-Populationen durch diagnostische PCR bestätigt (Abb. 2).

Erzeugung und Genotypisierung transgener P. berghei-Parasitenlinien. (A) Schematische Darstellung der modifizierten Fabg-Allele in der Parasitenlinie FabG/GFP, die durch einzelne Crossover-homologe Rekombination erzeugt wurden. Das fabg-Gen ist in Grau mit der kodierenden Sequenz (breite Balken) und den untranslatierten 5′- und 3′-Regionen (schmale Balken) dargestellt. Außerdem gezeigt sind die PacI-Restriktionsstelle, die für die homologe Single-Crossover-Rekombination verwendet wird, das gfp-Modul, der selektierbare Marker (hdhfr) und die Positionen der Primer P1-P3, die für die diagnostische PCR-Amplifikation verwendet werden. Beachten Sie, dass diese Strategie ein zweites, unverändertes Fabg-Allel hinterlässt. (B) PCR mit den Primern P1 und P3 zur Diagnose der Integration der modifizierten fabg::gfp-Allele in den Fabg-Locus oder mit den Primern P1 und P3 zur Diagnose der Abwesenheit des unveränderten Eltern-Fabg-Allels. (C) Schematische Darstellung des modifizierten kcr-Allels in der Parasitenlinie KCR/GFP, das durch homologe Doppel-Crossover-Rekombination erzeugt wurde. Das kcr-Gen ist in Grau mit der kodierenden Sequenz (breite Balken) und den nicht translatierten 5′- und 3′-Regionen (schmale Balken) dargestellt. Außerdem werden das gfp-Modul, der selektierbare Marker (hdhfr) und die Positionen der Primer P4-P6 gezeigt, die für die diagnostische PCR-Amplifikation verwendet werden. (D) PCR mit den Primern P4 und P5 zur Diagnose der Integration der modifizierten kcr::gfp-Allele in den kcr-Locus oder mit den Primern P6 und P5 zur Diagnose der Abwesenheit des unveränderten parentalen kcr-Allels. Primersequenzen finden Sie im Abschnitt „Methoden“. Vollständige Bilder der DNA-Agarose-Gele finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die Beurteilung der GFP-Expression durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie lebender FabG/GFP-Parasiten ergab einen Mangel an GFP-Fluoreszenz in Parasiten, Gameten und Ookineten im Blutstadium (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die FabG-Expression in diesen Lebensstadien fehlt oder sehr gering ist. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den Transkriptomdaten für das Fabg-Gen von P. berghei, die sehr niedrige Transkriptwerte bei Parasiten im Blutstadium zeigen11. Überraschenderweise konnte die FabG-Expression jedoch problemlos in jungen Oozysten nachgewiesen werden (Abb. 3A). Die Fluoreszenz war in einer röhrenförmigen, verzweigten Struktur lokalisiert, die an den Apikoplasten erinnert (Abb. 3A), was mit der Lokalisierung von FAS in diesem Organell übereinstimmt. FabG::GFP blieb während der gesamten Entwicklung der Oozysten und in sporulierten Oozysten, die sich an diskreten Stellen befanden, im Apikoplasten lokalisiert, was wahrscheinlich auf die Aufteilung des röhrenförmigen Netzwerks des Apikoplasten in einzelne kleine Apikoplasten während der Sporozoitenknospung zurückzuführen ist (Abb. 3A)12. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass FabG in P. berghei in Oozysten und Oozysten-Sporozoiten vorhanden ist, was angesichts der berichteten Abwesenheit einer FabG-Expression in denselben Lebenszyklusstadien der verwandten Parasitenart P. yoelii, bei der FabG vorhanden ist, unerwartet war erstmals im Apikoplasten von Speicheldrüsen-Sporozoiten beobachtet3. Da FAS-Enzyme in einem Komplex wirken, haben wir untersucht, ob andere Komponenten dieses Enzymkomplexes in P. berghei-Oozysten exprimiert werden. Zu diesem Zweck suchten wir mithilfe der Reverse-Transkription-PCR13 nach dem Vorhandensein von mRNA, die für die Gene, die FabB/F, FabZ und FabI kodieren, in unsporulierten Oozysten spezifisch ist. Tatsächlich wurden DNA-Fragmente der erwarteten Größe für alle vier untersuchten mRNA-Arten PCR-amplifiziert (einschließlich FabG-kodierender mRNA als Positivkontrolle) (Abb. 3), was die Oozystenexpression aller vier FAS-spezifischen Gene bestätigte. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass P. berghei während der gesamten Oozystenentwicklung über einen funktionsfähigen FAS-Apparat verfügt, der sich im Apikoplasten befindet.

Expression von FAS-Enzymen in P. berghei-Oozysten. (A) Konfokale GFP-Fluoreszenz- und Hellfeldbilder von unsporulierten (4 und 8 Tage nach der Infektion) und sporulierenden (14 Tage nach der Infektion) Oozysten der Parasitenlinie FabG/GFP (Klon 1). Maßstabsbalken 5μm. (B) Reverse Transkriptions-PCR von unsporulierten Wildtyp-Oozystenproben mit Primern, die spezifisch für mRNA von Genen sind, die für FabB/F, FabG, FabZ und FabI kodieren, wobei Fragmente mit 639, 769, 562 bzw. 750 bp amplifiziert werden. Ein Vollbild des DNA-Agarose-Gels finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die berichtete redundante Funktion von FabG – und damit von FAS – in Oozysten1 stand auf den ersten Blick im Widerspruch zur oozystenspezifischen Expression von FabG in P. berghei (Abb. 3). Eine mögliche Erklärung ist, dass der Verlust von FabG in diesen Oozysten durch die andere vom Parasiten kodierte Ketoacylreduktase kompensiert wird: KCR (PBANKA_0522400), die normalerweise Teil von FAE ist (Abb. 1). Insbesondere wird berichtet, dass KCR-Nullmutantenparasiten von P. berghei Oozysten produzieren, die keine Sporozoiten bilden können1, ein Phänotyp, der dem der FabI- und FabB/F-Enzym-Nullmutanten in P. falciparum4 sehr ähnlich ist. Um diese Hypothese zu testen, haben wir durch allelischen Ersatz des Wildtyp-kcr-Gens eine transgene Parasitenlinie erzeugt, die KCR exprimiert, das an seinem Carboxyterminus mit GFP fusioniert ist (Abb. 2C). Die diagnostische PCR über die 3'-Integrationsstelle amplifizierte ein etwa 2 kb großes Fragment der erwarteten Größe (Abb. 2D) und bestätigte die Integration des modifizierten kcr::gfp-Allels in den Zielort der resultierenden KCR/GFP-Parasitenlinie. Darüber hinaus wurde das Fehlen des Wildtyp-kcr-Allels in klonalen Populationen von KCR/GFP durch diagnostische PCR bestätigt (Abb. 2D).

Die berichtete Transkriptexpression des kcr-Gens in Parasiten im Blutstadium von P. berghei zeigte die höchsten Werte in weiblichen Gametozyten11,14 und es wird vorausgesagt, dass seine mRNA einer Transkriptionsrepression unterliegt15. Diese Daten deuteten darauf hin, dass das KCR-Protein nach der Befruchtung exprimiert wurde. In Übereinstimmung damit zeigte die Live-Fluoreszenzmikroskopie der Parasitenlinie KCR/GFP deren Expression in Ookineten (Abb. 4A). Der KCR-Funktionsverlust-Phänotyp1 deutete darüber hinaus auf seine Expression in Oozysten hin, und dies wurde tatsächlich durch das Vorhandensein von KCR::GFP-basierter Fluoreszenz in diesen Lebensstadien bestätigt (Abb. 4B, C). Die Parasitenlinie KCR/GFP bildete Sporozoiten und die auf KCR::GFP basierende Fluoreszenz in aufkeimenden Sporozoiten und in vollständig sporulierten Oozysten war deutlich schwächer als im Oozystensporoblasten (Abb. 4D, E), was darauf hindeutet, dass die KCR-Expression herunterreguliert ist, aber nicht fehlt. in Sporozoiten. Die normale Sporozoitenentwicklung in der Parasitenlinie KCR/GFP weist darauf hin, dass die GFP-Fusion die KCR-Funktion und damit die subzelluläre Lokalisierung des Proteins nicht beeinträchtigt hat. Die Lokalisierung der KCR::GFP-basierten Fluoreszenz unterschied sich von der mutmaßlichen Apikoplasten-spezifischen Lokalisierung von FabG und zeigte stattdessen eine weiter verbreitete subzelluläre Verteilung, die mit einer Lokalisierung in ER-Membranen übereinstimmt (Abb. 4). Diese mutmaßliche Lokalisierung stimmt mit der vorhergesagten Struktur von KCR überein, das zusätzlich zu seiner mit FabG geteilten zentralen Enzymdomäne eine Amino-terminale Transmembranhelix und ein Carboxy-terminales Di-Lysin-ER-Retentionssignal besitzt. Die deutliche subzelluläre Lokalisierung von KCR macht es unwahrscheinlich, dass es den FabG-Verlust in der gemeldeten FabG-Nullmutante von P. berghei1 kompensieren kann, was darauf hindeutet, dass es in der Oozyste keine funktionelle Überlappung zwischen FAS und FAE gibt. Der berichtete P. berghei KCR-Nullmutanten-Phänotyp1 weist daher auf eine wesentliche Rolle von FAE bei der Sporozoitenbildung innerhalb der Oozyste hin. Ein ähnlicher Funktionsverlust-Phänotyp wurde für das FAE-Enzym DEH (Abb. 1) in P. berghei16 berichtet. Zusammenfassend deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass P. berghei-Oozysten auf FAE angewiesen sind und nicht in der Lage sind, aus ihrer Umgebung irgendwelche oder zumindest ausreichende Mengen an langkettigem FA zu erhalten.

Expression von KCR in P. berghei. Konfokale GFP-Fluoreszenz- und Hellfeldbilder der Parasitenlinie KCR/GFP (Klon 1), die zeigen (A): einen reifen Ookineten; (B): Gruppe von drei jungen Oozysten 4 Tage nach der Infektion; (C): eine unsporulierte Oozyste 8 Tage nach der Infektion; (D) eine sporulierende Oozyste 14 Tage nach der Infektion; (E) eine vollständig sporulierte Oozyste 14 Tage nach der Infektion. Maßstabsbalken 10 μm.

Der offensichtliche Unterschied in der FabG-Expression zwischen P. berghei (Abb. 3) und P. yoelii3 war angesichts der engen evolutionären Beziehung zwischen diesen beiden Nagetier-Malariaparasitenarten überraschend. Es ist zu beachten, dass unterschiedliche Techniken zur Visualisierung der FabG-Expression und -Lokalisierung verwendet wurden, nämlich GFP-Tagging in Kombination mit Live-Fluoreszenzmikroskopie (P. berghei) und Myc-Tagging in Kombination mit Immunfluoreszenz (P. yoelii), die möglicherweise zu diesen verwirrenden Ergebnissen beigetragen haben . Während der erste Ansatz kaum Raum für falsch positive Ergebnisse lässt, ist die Färbung der inneren Oozyste mittels Immunfluoreszenz aufgrund der für Antikörper schlecht durchlässigen Oozystenkapsel schwieriger. Für bare Münze genommen zeigen die hier präsentierten Ergebnisse jedoch, dass P. berghei hinsichtlich der FAS-Enzymexpression und der Abhängigkeit von FAS in den Oozystenstadien eine Position zwischen der von P. yoelii und P. falciparum einnimmt. Oozysten von P. berghei können die FA-Abfangung aus der Hämolymphe der Mücke eindeutig nutzen, um die Entwicklung von Oozysten und Sporozoiten in Abwesenheit von funktionsfähigem FAS1 zu unterstützen. Warum investieren P. berghei-Oozysten dann Ressourcen in die Expression eines intakten FAS-Systems? Eine Erklärung ist, dass FAS einen selektiven Vorteil unter Bedingungen bietet, die sich von denen unterscheiden, die bei der Analyse der FabG-Nullmutanten-Phänotypen verwendet werden1. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu beachten, dass bei experimentellen Mückeninfektionen den bluternährten Insekten keine Eier gelegt werden dürfen, was zu einem Nährstoffrecycling durch Follikelresorption und einer höheren Nährstoff-/Lipidverfügbarkeit für die Oozystenentwicklung führt als unter natürlichen Bedingungen beim Eierlegen würde normalerweise verlegt werden. Niedrige Hämolymph-FA-Werte könnten auch in Situationen mit hoher Oozystenbelastung erreicht werden, wenn das Oozystenwachstum möglicherweise die FA-Ressourcen erschöpfen könnte, bevor die Sporozoitenknospung beginnt. In solchen Situationen könnte FAS eingreifen, um die Sporozoitenbildung zu fördern/zu retten und die Übertragung sicherzustellen. Tatsächlich werden das Oozystenwachstum und die Sporogonie von P. berghei durch die Ansammlung sowie durch die Senkung des Lipidspiegels im Insekt durch Lipophorin-Knockdown reduziert5,6,17. Während der Beitrag von FAS zur Oozystenentwicklung und Sporogonie bei P. falciparum eindeutig wichtiger ist als bei P. berghei1,4, handelt es sich dabei letztlich möglicherweise eher um einen quantitativen als um einen qualitativen Unterschied zwischen diesen Plasmodium-Arten, der biologische Unterschiede beispielsweise in ihrer Wirksamkeit widerspiegelt der Lipidaufnahme oder ihres gesamten FA-Bedarfs.

Das Potenzial von Plasmodium-Oozysten, FAS neben der FA-Abfangung zu nutzen – wie in diesem Artikel aufgezeigt – ist relevant für die nicht konkurrierende Beziehung der Ressourcenausbeutung, die zwischen Plasmodium-Parasiten und ihren Mückenvektoren besteht und die Parasitenvirulenz bei beiden beeinflusst das Insekt und der Wirt5,7. Der Lipidtransport durch Mücken durch Lipophorin ist ein wichtiger Faktor in diesem Prozess5,7. Diese nicht konkurrierende Strategie zur Optimierung der Übertragung bei gleichzeitiger Minimierung der Kosten für die Fortpflanzungsfähigkeit des Insekts kann dadurch erreicht werden, dass der Parasit „überschüssige“ Nahrungsressourcen nutzt, die nicht in die Oogenese investiert wurden, oder indem er diese Ressourcen erst nach Abschluss der Eibildung nutzt5,7. Die Fähigkeit des Parasiten, auf FAS umzuschalten, könnte ein wichtiger zusätzlicher Faktor sein. Eine höhere Verfügbarkeit von Lipiden könnte das Abfangen von FA stimulieren, während niedrigere Lipidspiegel FAS stimulieren könnten, was in jedem Fall die Sporogonie fördert, ohne die Fitness der Mücke zu beeinträchtigen, und es dem Parasiten ermöglicht, seine Beziehung zur Mücke so zu optimieren, dass FA-basierte Nährstoffe für eine optimale Entwicklung ausgenutzt werden Übertragung. In jedem Fall sollte der Zugang zu FA sowohl durch Synthese als auch durch Abfangen der Plasmodium-Oozyste eine größere Vielseitigkeit verleihen, um mit Umweltveränderungen innerhalb des Vektors umzugehen.

Wie bereits beschrieben10, wurden alle Labortierversuche in Übereinstimmung mit dem United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act 1986 zur Umsetzung der europäischen Richtlinie 2010/63 zum Schutz von zu Versuchszwecken verwendeten Tieren durchgeführt und von der London School of Hygiene & Tropical genehmigt Ethisches Prüfgremium für den Tierschutz in der Medizin und Innenministerium des Vereinigten Königreichs. Die Experimente wurden typischerweise an 6–8 Wochen alten CD1-Mäusen durchgeführt, die frei von bestimmten Krankheitserregern waren und in Filterkäfigen gemäß den ARRIVE-Richtlinien gehalten wurden. Das Wohlergehen der Tiere wurde täglich beurteilt und bei Erreichen experimenteller oder klinischer Endpunkte wurden die Tiere auf humane Weise eingeschläfert, indem sie Kohlendioxidgas in steigender Konzentration ausgesetzt wurden. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion oder durch infizierte Mückenstiche bei anästhesierten Tieren mit Parasiten infiziert, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert waren. Die intraerythrozytäre Parasitämie wurde regelmäßig durch Mikroprobenentnahme von Blut aus einer oberflächlichen Schwanzvene überwacht. Medikamente wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht oder, wenn möglich, über das Trinkwasser zugeführt. Parasitiertes Blut wurde durch Herzblutung unter Vollnarkose ohne Genesung entnommen.

P. berghei ANKA-Klon 2.34-Parasiten wurden als kryokonservierte Stabilate oder durch mechanische Blutpassage und regelmäßige Mückenübertragung gehalten, wie zuvor beschrieben10. Die Mückeninfektions- und Übertragungstests erfolgten wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Anopheles stephensi18,19 und infizierte Insekten wurden bei 20 °C und etwa 70 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-Stunden-/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Wie beschrieben wurden über Nacht Ookinetenkulturen aus Gametozytenblut angelegt20.

Um eine Parasitenlinie zu erzeugen, die an GFP fusioniertes FabG (FabG/GFP) exprimiert, wurde ein etwa 2,2 kb großes Fragment, das der kodierenden Sequenz (plus Introns) und 5'UTR von PBANKA_0823800 entspricht, mit den Primern FabG-F (TTGGGCTGCAGTCGAGGAATTTCCATAGCATCCATATATAC) und FabG PCR-amplifiziert -R (AATGAGGGCCCCTAAGCTGGTACCACTTGATAATCCACCATCAATTATAAATAC) isoliert und durch Infusion in mit SalI/HindIII verdautes pBS-EGFP-hDHFR10 kloniert, um das Plasmid pBS-FabG/GFP zu ergeben. Dieses Plasmid wurde mit PacI linearisiert und in gereinigte Schizonten zur Integration in den Fabg-Locus durch homologe Single-Crossover-Rekombination transfiziert (Abb. 2A).

Um eine Parasitenlinie zu erzeugen, die an GFP fusioniertes KCR (KCR/GFP) exprimiert, wurde die kodierende Sequenz von PBANKA_005524 plus etwa 0,45 kb des 5'UTR mit den Primern pDNR-05524-F (ACGAAGTTATCAGTCGAGGTACCTGATTCAACTATATTACCGCAGATAC) und pDNR-05524-R PCR-amplifiziert ( ATGAGGGCCCCTAAGCTTTCTTCTTTCTTCATTTTTTTCAAC) und über In-Fusion-Klonierung in SalI/HindIII-verdautes pDNR-EGFP eingeführt, um das Plasmid pDNR-KCR/EGFP zu ergeben. Eine etwa 0,77 kb große Sequenz, die der 3'UTR von PBANKA_005524 entspricht, wurde mit den Primern pLP-05224-F (ATATGCTAGAGCGGCCAGTGTGCTCACTTTTTGTTATTTTG) und pLP-05224-R (CACCGCGGTGGCGGCCTTTGGAAAATATGCAAAGC) PCR-amplifiziert und über In-Fusion clo in NotI-verdautes pLP-hDHFR eingeführt ning zu Geben Sie das Plasmid pLP-hDHFR/KCR. Die kcr-spezifische Sequenz von pDNR-KCR/EGFP wurde über eine ortsspezifische Cre-loxP-Rekombination in pLP-hDHFR/KCR eingeführt, um das endgültige Konstrukt pLP-KCR/EGFP zu ergeben. Dieses Plasmid wurde mit KpnI und SacII linearisiert und in gereinigte Schizonten zur Integration in den kcr-Locus durch homologe Double-Crossover-Rekombination transfiziert (Abb. 2C).

Parasitentransfektion, Pyrimethamin-Selektion und limitierende Verdünnungsklonierung wurden wie beschrieben durchgeführt21,22.

Die Extraktion genomischer DNA für die diagnostische PCR wurde wie beschrieben durchgeführt19. Um die Integration des modifizierten GFP-markierten Fabg-Allels in den Zielort zu bestätigen, wurde genomische DNA der FabG/GFP-Parasitenlinie einer diagnostischen PCR mit den Primern P1 (ATGTGCAGTGATTTTGCATATCT) und P2 (GTGCCCATTAACATCACC) unterzogen, um ein etwa 2,4 kb großes Fragment über den Locus zu amplifizieren 5'-Integrationsstelle (Abb. 2A,B). Das Fehlen des parentalen unmodifizierten Fabg-Allels (2,9 kb) wurde durch PCR mit den Primern P1 und P3 (CACCGCGGTGGCGGCCCTTATAAGTATTCTTCTCATATTTCCCGT) beurteilt (Abb. 2A, B).

Um die Integration des GFP-markierten kcr-Allels in den Zielort zu bestätigen, wurde genomische DNA der KCR/GFP-Parasitenlinie einer diagnostischen PCR mit den Primern P4 (ACAAAGAATTCATGGTTGGTTCGCTAAACT) und P5 (CATTAGCATTAGGTTTCATTTCATTAC) unterzogen, um ein etwa 2,0 kb großes Fragment über die 3 zu amplifizieren '-Integrationsstelle (Abb. 2C,D). Das Fehlen des parentalen kcr-Allels (3,0 kb) wurde durch PCR mit den Primern P6 (ACGAAGTTATCAGTCGAGGTACCTGATTCAACTATATTACCGCAGATAC) und P5 (Abb. 2C, D) beurteilt.

Bilder von DNA-Agarose-Gelen in voller Größe mit vollständigen DNA-Leitern sind in der Datei mit ergänzenden Informationen enthalten, wobei die in Abb. 2 verwendeten Regionen mit roten Kästchen gekennzeichnet sind.

Wie zuvor beschrieben13, etwa 30 An. Stephensi-Oozysten enthaltende Mitteldärme, die sieben Tage nach einer mit Wildtyp P. berghei infizierten Blutmahlzeit entnommen wurden, wurden präpariert und gepoolt, und die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert. Um restliche genomische DNA-Kontaminationen zu entfernen, wurden RNA-Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur einer DNase I-Behandlung (Amplifikationsgrad, Sigma) unterzogen, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung des Enzyms. Nach einem zweiten RNeasy-Reinigungsschritt zur Entfernung der DNase I wurden die RNA-Proben mit der Reversen Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (RNaseH minus, Punktmutation, Promega) in Gegenwart von Oligo(dT)25 bei 50 °C für 1 Stunde revers transkribiert , gefolgt von Hitzeinaktivierung. Die resultierenden cDNA-Proben wurden mit dem QIAquick-Gelextraktionskit (Qiagen) säulengereinigt und in Wasser eluiert. Fab-Enzym-spezifische cDNA wurde PCR-amplifiziert (25 Zyklen) mit den Primerpaaren CATAATCTGAATAAGGTTAATCCAAATAAG und TACCATATTTGCAATCTCTTCTGG (FabG, Fragmentgröße 769 bp); GAAGATAACATGTTTCACTAACAATGG und ATACCACCACCATATCCAGGTAC (FabI, Fragmentgröße 750 bp); TTTTTGGTTCACCAAGTGTATAGC und GCGCATGCACTTAACATACC (FabB/F, Fragmentgröße 639 bp); GAAACTTTTTATAATTTTTTTTTACGTCC und CACTAATGTATCGCCTGGTAAAAC (FabZ, Fragmentgröße 562 bp). Diese Primer wurden so konzipiert, dass sie nach Möglichkeit eine Intron-Spleißstelle umfassen, um eine mRNA-spezifische Amplifikation sicherzustellen. Ein Bild der DNA-Agarose-Gele in voller Größe mit vollständiger DNA-Leiter ist in der Datei mit den ergänzenden Informationen enthalten.

Lebende Parasitenproben wurden wie beschrieben auf einem konfokalen Zeiss LSM880-Laser-Scanning-Mikroskop unter Verwendung eines 100-fachen Ölobjektivs und der Software ZEN Blue Version 3.0 beurteilt und Bilder aufgenommen10. Die Proteinexpression und die subzelluläre Lokalisierung wurden in Oozysten von Mückengruppen, die mit nicht geklonten und geklonten Populationen transgener Parasiten infiziert waren, bewertet und verglichen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse konsistent und repräsentativ waren.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Stanway, RR et al. Identifizierung wesentlicher Stoffwechselprozesse im Genommaßstab zur Bekämpfung des Plasmodium-Leberstadiums. Zelle 179, 1112–1128 e1126. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.030 (2019).

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Diese Arbeit wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Zuschuss BB/V006428) und dem UK Medical Research Council (Zuschuss MR/P021611) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sadia Saeed und Annie Z. Tremp.

Abteilung für Infektionsbiologie, Fakultät für Infektions- und Tropenkrankheiten, London School of Hygiene & Tropical Medicine, Keppel Street, London, WC1E 7HT, Großbritannien

Sadia Saeed, Annie Z. Tremp und Johannes T. Dessens

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JTD trug zur Konzeptualisierung bei; SS, AT und JTD führten Ermittlungen durch; JTD hat das Papier verfasst und die Finanzierung eingeworben.

Korrespondenz mit Johannes T. Dessens.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Saeed, S., Tremp, AZ & Dessens, JT Plasmodium berghei-Oozysten verfügen über Fettsäuresynthese- und -abfangwege. Sci Rep 13, 12700 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39708-z

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Eingegangen: 29. Mai 2023

Angenommen: 29. Juli 2023

Veröffentlicht: 05. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39708-z

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